Okazaki fragment[오카자키 단편]의 존재 증명
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작성일 21-06-16 01:10
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E. coli DNA의 80% 이상과 T4 phage에 감염된 cell들의 pulse labeled DNA 50-80% 가량이 이 과정으로 복구된다.
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DNA replication에서 daughter strand에서 leading strand는 연속으로, lagging strand는 short fragment를 형성하면서 불연속적으로 합성된다.
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DNA 변성: native 상태에서 추출된 DNA는 20분 동안 실온에서 1mM의 EDTA를 포함한 0.1N NaOH에서 배양되면서 변성된다.
Thomas procedure에 의한 native DNA 추출: 이것은 몇가지 실험(SDS(sodium dodecyl sulfate)처리는 37℃에서, 그리고 DNA 용액은 collodion membrane을 통한 여과에 의해 모은다)외에는 이전에 설명(說明)된 것과 같이 수행한다. cell들이 기대한 시간동안 -thymine을 통합하게 한 후에, culture를 부순 얼음과 KCN (0.02 M까지)에 붓는다. E. coli 15를 pulse label하기 위해 thymidine을 함유한 medium에서 키운 cell들을 촉진시키고 thymine을 함유하지 않은 0℃의 소량의 신선한 medium에서 재부유시킨다.
다. Okazaki 박사는 이를 E.coli 實驗(실험)으로 증명하였다. 그리고 cell들은 0℃에서 centrifuge하여 모은다. culture 1ml에서 0.5~1ml의 DNA가 최종적으로 얻어진다. Okazaki 박사는 이를 E.coli 실험으로 증명하였다. suspension은 간간이 유리막대로 약하게 휘저어지면서 20분 동안 37℃로 배양하며 불용성 물질은 저속의 centrifugation으로 제거한다. -thymine( M)을 첨가시키면 反應은 KCN과 얼음에 의해 멈춘다. cell suspension은 20℃의 더 많은 양의 stirred medium에 붓는다.
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Okazaki fragment[오카자키 단편]의 존재 증명
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DNA replication에서 daughter strand에서 leading strand는 연속으로, lagging strand는 short fragment를 형성하면서 불연속적으로 합성된다된다.
설명
hymine이 불필요한 박테리아나 T4 phage에 감염된 cell을 pulse label하기 위해 -thymine (14 mc/μmole)을 20℃(B. subtilis는 30℃)의 stirred culture(5 X 108 cells/ml)에 넣어 M이 되게 한다. E. coli 15로는, 회복이 30~60%로 다양하지만 병행된 실험에서 pulse labeled DNA와 uniformly labeled DNA간의 구조적 차이는 발견되지 않았다. 이중 lagging strand에 형성되는 short fragment를 Okazaki fragment라고 한다.
NaOH-EDTA에 의한 denatured DNA 추출: cell들은 0.01M EDTA(ethylenediamineteraacetic acid)를 함유한 얼음같이 찬 0.1N NaOH에 5X cells/ml의 농도로 고정된다. 이중 lagging strand에 형성되는 short fragment를 Okazaki fragment라고 한다.
